جداسازی و شناسایی سروتیپ های سالمونلاهای جدا شده از تخم مرغ های بومی و صنعتی استان مازندران با استفاده از PCR (2)

عنوان

جداسازی و شناسایی سروتیپ های سالمونلاهای جدا شده از تخم مرغ های بومی و صنعتی استان مازندران با استفاده از PCR

فهرست مطالب

عنوان صفحه

چکیده ....................................... 1

1. فصل اول : مقدمه و هدف

1-1. مقدمه ................................... 3

1-2. هدف ..................................... 18

2. فصل دوم : کلیات

2-1. پیشینه تحقیق.............................. 20

2-2. ساختمان و ارزش غذایی تخم مرغ.............. 30

2-3. نحوه نگهداری و ذخیره سازی تخم مرغ......... 47

2-4. انواع درجه بندی تخم مرغ................... 48

2-5. مکانیسم های دفاعی تخم مرغ................. 48

2-6. میکروبیولوژی تخم مرغ...................... 52

2-7. باکتری سالمونلا............................ 53

3. فصل سوم: مواد وروش ها

3-1. وسایل و مواد مورد استفاده................. 67

3-2. روش کار .................................. 69

3-2-2. آماده سازی محتویات نمونه های تخم مرغ جهت کشت باکتریایی72

3-2-6 . مرحله تایید ........................... 74

3-2-6-3 . آزمون های سرولوژیکی ................. 77

3-2-6-3-1 . حذف سوش های خودآگلوتینه ............ 77

3-2-6-3-2 . آزمون برای تشخیص وجود آنتی ژن O,Vi,H78

3-2-6-4. تفسیر نتایج واکنش های سرولوژیکی و بیوشیمیایی 78

3-2-6-5 . استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR) 78

3-2-6-5-6: رسم درخت فیلوژنی..................... 84

3-3. روش های آماری آنالیز یافته ها............. 85

4. فصل چهارم: نتایج تحقیق

4-1. نتایج..................................... 85

4-1-5 . نتایج تست های بیوشیمیایی............... 90

4-1-6. نتایج آزمون های سرولوژیکی............... 91

4-1-7. نتایج آزمون PCR......................... 91

4-1-8 . نتایج میزان آلودگی تخم مرغ های بومی و ماشینی استان مازندران ...................................... 96

4-1-8-2. نتایج آزمون های آماری آلودگی تخم مرغ های بومی و ماشینی شهرستان ها..................................... 96

5. فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1. بحث....................................... 106

5-2. نتیجه گیری................................ 109

5-3. پیشنهادات................................. 110

منابع.......................................... ... 111

پیوست.......................................... 119

چکیده انگلیسی.................................. 123

فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول1-1. شیوع مسمومیت های غذایی سالمونلایی ناشی از مصرف تخم مرغ و محصولات

تخم مرغ از سال های 2002-1998................... 7

جدول1-2. حامل های غذایی در 35 مورد شیوع سالمونلا انتریتیدیس در امریکا از سال

1987تا1985..................................... 9

جدول1-3. لیست توزیع فراوان ترین سروتیپ سالمونلا گزارش شده در 2001 تا2000......................................... 16

جدول 2-1. خلاصه ای از برخی موارد شیوع سالمونلوسیس غذایی 23

جدول 2-2. تخم مرغ به عنوان شیوع سالمونلا در ویکتوریا 27

جدول 2-3. ترکیبات تشکیل دهنده تخم مرغ کامل..... .39

جدول 2-4. چربی های تشکیل دهنده تخم مرغ......... .41

جدول 2-5. پروتئین های سفیده تخم مرغ و خلاصه ای از خصوصیات آن ها............................................. 43

جدول 3-1. توزیع نمونه گیری از تخم مرغ های بومی مصرفی شهرستان های استان

مازندران....................................... .70

جدول 3-2. توزیع نمونه گیری از تخم مرغ های ماشینی مصرفی شهرستان های استان

مازندران ..................................... 71

جدول 3-3. مشاهده تغییرات بدست آمده از کشت پرگنه مشکوک در محیط TSi 75

جدول 3-4. مشخصات سالمونلا از نظر واکنش های بیوشیمیایی77

جدول3-5. تفسیر مشاهده ات بدست آمده از واکنش های بیوشیمیایی و سرولوژیکی...................................... 78

جدول 3-6. مشخصات پرایمرهای 16S rRNA............. 80

فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار2-1. تغییرات عفونت های سالمونلایی و اشریشیا از 2010-199626

نمودار2-2. مواد غذایی وابسته به شیوع سالمونلا... 26

نمودار4-1. میزان آلودگی تخم مرغ های بومی شهرستان گلوگاه 96

نمودار4-2. میزان آلودگی تخم مرغ های بومی شهرستان بهشهر 97

نمودار4-3 میزان آلودگی تخم مرغ های بومی شهرستان میاندرود 97

نمودار4-4. میزان آلودگی تخم مرغ های بومی شهرستان نکا 98

نمودار4-5. میزان آلودگی تخم مرغ های بومی شهرستان ساری 98

نمودار4-6. میزان آلودگی تخم مرغ های بومی شهرستان بابل 99

نمودار4-7. میزان آلودگی تخم مرغ های ماشینی شهرستان گلوگاه 100

نمودار 4-8.. میزان آلودگی تخم مرغ های ماشینی شهرستان بهشهر 100

نمودار4-9. میزان آلودگی تخم مرغ های ماشینی شهرستان نکا 101

نمودار 4-10. مقایسه میانگین تخم مرغ های آلوده بومی و ماشینی 102

نمودار4-11. تنوع بین شهرستان ها از لحاظ آلودگی باکتریایی 103

نمودار4-12. مقایسه شهرستان های مورد بررسی از لحاظ آلودگی تخم مرغ های بومی....................................... 104

فهرست شکل ها

عنوان صفحه

شکل 2-1. اندام های تناسلی سازنده تخم مرغ....... 30

شکل 2-2. ساختمان تخم مرغ کامل.................. 33

شکل 2-3. لایه های مختلف تشکیل دهنده پوست تخم مرغ34

شکل 2-4. ترکیبات پروتئینی پوستتخم مرغ......... 39

شکل 2-5. مختصری از دفاع فیزیکی و شیمیایی تخم مرغ48

شکل 2-6. طبقه بندی سروتیپ های سالمونلا.......... 57

شکل 3-1. برخی از وسایل مورد استفاده جهت کشت نمونه 68

شکل 3-2. نمونه ای از یک محیط کشت مورد استفاده.. ..69

شکل 3-3. تخم مرغ بومی جهت انجام آزمایش......... 70

شکل 3-4. تخم مرغ ماشینی جهت انجام آزمایش...... 71

شکل 3-5. تهیه تخم مرغ های ماشینی جهت انجام آزمایش 72

شکل 3-6. آماده سازی نمونه ها جهت کشت در محیط پپتون واتر 72

شکل 3-7. محتویات آماده شده در محیط پپتون واتر.. 73

شکل3-8 . آماده سازی محتویات در محیط سلنیتF..... .73

شکل3-9. تلقیح باکتری بر روی محیط های افتراقی جامد .74

شکل 3-10. دستگاه uvidoc برای عکسبرداری نمونه ها بر روی ژل آگاروز 83

شکل 3-11. الکتروفروز ژل الکتروفروز............. 83

شکل 4-1. نمونه مشکوک رشد کرده در ارلن پپتون واتر بعد ار 20 ساعت 87

شکل4-2. نمونه مشکوک رشد کرده در محیط آبگوشت سلنیت 88

شکل4-3. پرگنه های مشکوک روی محیط سالمونلا- شیگلا آگار 88

شکل4-4. پرگنه مشکوک بر روی محیط ائوزین متیلن بلو89

شکل4- 5. نمونه مشکوک بر روی محیط نوترینت آگار.. 89

شکل4-6. مشاهده پرگنه های مشکوک زیر میکروسکوپ... 90

شکل4-7. نمونه مشکوک بر روی محیط TSI............. 90

شکل 4-8. نتایج تست های بیوشیمیایی نمونه مشکوک.. 91

شکل 4-9. نتایج آزمون های سرولوژیکی نمونه مشکوک. 91

شکل 4-10. باند 16S rDNA نمونه مشکوک............. 92

شکل4-11. هم تراز سازی توالی نمونه مشکوک به سالمونلا 94

شکل 4-12. درخت فیلوژنی باکتری مشکوک............ 95

چکیده

سابقه و هدف

تخم مرغ و محصولات تخم مرغ آلوده یکی از منابع مهم بیماری های ناشی از غذا مثل سالمونلوسیس است. سالمونلوسیس یکی از عمده ترین و وسیع ترین بیماری ناشی از غذا در سرتاسر جهان است، در هر سال میلیون ها مورد انسانی در تمام دنیا گزارش می شود، و در هزاران نفر منجر به مرگ می شود. تحقیق حاضر با هدف تعیین میزان آلودگی تخم مرغ های مصرفی بومی و ماشینی استان مازندران به باکتری سالمونلا انجام شد.

روش تحقیق

در این مطالعه توصیفی مقطعی،ازاوخر فروردین91 تا اوایل مرداد91، تعداد200 عدد تخم مرغ بومی و 56 عدد تخم مرغ ماشینی از سطح استان مازندران جمع آوری و محتویات آن ها از نظر آلودگی سالمونلایی مورد بررسی قرار گرفتند. تخم مرغ های بومی و ماشینی هر یک پس از مخلوط کردن به طور جداگانه درون 45 میلی لیتر محیط پپتون واتر اضافه شدند، در ادامه بر اساس روش های کشت استاندارد عمل جداسازی صورت گرفت و بر روی تمامی باکتری های جدا شده از محیط های کشت افتراقی، آزمایشات دقیق بیوشیمیایی انجام شد، سپس جهت تشخیص قطعی سالمونلا از آزمون های سرولوژیکی و PCR استفاده شد.

یافته ها

پس از انجام مراحل کشت، از مجموع 200 عدد تخم مرغ بومی مورد بررسی، یک عدد تخم مرغ مشکوک به باکتری سالمونلا یافت شد که بعد از انجام آزمون PCR مشخص شد که متعلق به گونه سیتروباکتر فروندی است و در56 عدد تخم مرغ های ماشینی هیچ یک از تخم مرغ ها به باکتری سالمونلا آلوده نبودند، همچنین مشاهده شد که از مجموع 56 عدد تخم مرغ ماشینی3/5% تخم مرغ ها به باکتری اشرشیا و 7/1% به باکتری سیتروباکتر آلوده بودند و همچنین 5/6% تخم مرغ های بومی به باکتری اشریشیا، 5/2% به باکتری کلبسیلا، 5/1% به باکتری شیگلا و 9% به باکتری سیتروباکتر آلوده بودند.

نتیجه گیری

با توجه به نتایج بدست آمده، در هیچکدام از نمونه تخم مرغ های بومی و ماشینی مصرفی استان مازندران در این تحقیق آلودگی سالمونلایی مشاهده نشده است، ولی آلودگی محتویات تخم مرغ های بومی و ماشینی به باکتری های دیگر مشاهده شده است که لازم است اقدامات بهداشتی بیشتری در این مناطق صورت گیرد.

واژه های کلیدی: تخم مرغ ، سالمونلا، سالمونلوسیس، گاستروانتریت

فصل اول

مقدمه و هدف

1-1. مقدمه

1-1-1. خصوصیات تخم مرغ

تخم مرغ یک غذای پایه ای دارای اهمیت برای میلیون ها نفر در سرتاسر دنیا است(31). از پرزرده ترین تشکیلات یاخته تناسلی در حیوانات تخمگذار است(12). تخم مرغ به خاطر استفاده راحت یکی از پرمصرف ترین مواد غذایی مورد استفاده انسان است(12). یکی از کامل ترین منابع غذایی حیوانی برای انسان و در صورت لزوم حیوانات به شمار می رود که خلقت آن را به عالی ترین وجه و شکل ممکن بسته بندی نموده است(12).

تخم پرندگان یکی از غذاهای معمول و همچنین یکی از متنوع ترین مواد غذایی است که در آشپزی مورد استفاده قرار می گیرد و رایج ترین مورد استفاده از تخم پرندگان، تخم مرغ است. اما تخم دیگر پرنده ها مثل شترمرغ، اردک، بلدرچین نیز توسط انسان ها مصرف می شوند. تخم ها معمولا به صورت تخم با پوسته فروخته و مصرف می شوند، برای مصارف تجاری و در سرویس های آماده سازی غذاها تخم ها از پوسته شکسته می شوند و سپس ممکن است به طور کامل یا به صورت زرده و سفیده جدا مصرف شوند(66).

تخم مرغ ها یک منبع خوبی از پروتئین های با کیفیت بالا هستند. آن ها تامین کننده منابع خوبی از آهن، ویتامین ها و فسفوروزها هستند. به عنوان یک منبع مغذی از ویتامین D و در رتبه دوم بعد از روغن کبد ماهی هستند. تخم مرغ ها مقدار کلسیم کمی دارند که در پوسته یافت می شود و حاوی مقدار کمی از ویتامین C هستند(65).

تخم مرغ ها تامین کننده یک منبع مغذی متعادل و خوب برای بشر در همه سن ها هستند، زرده تخم مرغ خیلی پخته شده یک حجم مغذی بزرگی به عنوان منبع تکمیلی بالای آهن برای بچه ها است و زمانی که بچه ها به سن یک سالگی می رسند ممکن است به آن ها سفیده تخم مرغ بدهند. حجم کالری کم، قابلیت هضم آسان و حاوی مواد مغذی بالا، تخم مرغ ها را به عنوان یک ماده گرانبها در رژیم های درمانی برای افراد مسن ساخته است. در دوران نقاهت هنگامی که یک رژیم غذایی ملایم مورد نیاز است تخم مرغ ها یک رژیم غذایی مطلوب را فراهم می کنند(65).

تخم مرغ یک منبع بالقوه خوب از مواد خام برای صنایع دارویی و آرایشی است. همچنین به طور وسیعی در صنایع غذایی استفاده می شود. تخم مرغ نقش مخمر، غلیظ کننده و چسباننده مواد را داراست که از جمله در سس هایی مانند سس مایونز استفاده می شود. در سایر موارد از جمله در غذاها و در دسرهای مخصوص و در انواع کرم ها که از تنوع بالایی برخوردارند، مصرف شده و به آن ها لطافت خاصی می بخشد. در رأس همه این نقش های پنهان، این ماده غذایی به تنهایی نیز مغذی و خوشمزه است خواه به صورت آب پز، نیمرو یا به صورت انواع املت ها باشد(57).

تخم مرغ با داشتن مقدار متوازنی از غنی ترین مواد پروتئینی، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی، ویتامین ها طی بیست روز دوران زندگی جنینی تنها منبع تامین غذای جنین این موجود می باشد(12).

مواد مغذی که تخم مرغ ها را یک ماده غذایی با کیفیت بالا برای بشر میسازند، یک محیط رشد خوب هم برای باکتری ها هستند (39).

وجود هرگونه دگرگونی درتخم مرغ بسهولت مورد توجه واقع می شود و برخورد کنندگان با این دگرگونی ها مصرا خواهان آگاهی از علت یا علل وجودی آنها هستند. فساد تخم مرغ، بدشکلی ها، تغییرات رنگ و بسیاری ناهنجاری ها از مسائلی می باشد که همیشه توجه خاص مصرف کنندگان این ماده غذایی را به خود جلب کرده اند. فساد تخم مرغ معمولا عفونتی است ناشی از اختلاطی از باکتری های گرم منفی و در بعضی موارد چند باکتری گرم مثبت(12).

تخم مرغ در صورت حملات میکروبی و فیزیکی دارای 2 مکانیسم دفاعی بزرگ است 1- سیستم محافظتی شیمیایی که از زرده و آلبومن تشکیل شده است 2- سد فیزیکی که از پروتئین های ماتریکسی پوست تخم مرغ تشکیل شده است در برابر حجوم باکتریایی، تخم مرغ را محافظت می کند(31).

1-1-2. بیماری های منتقله از غذا

تمام بیماری های ناشی از مصرف مواد غذایی به دو دسته مسمومیت ها [1] و عفونت ها[2] تقسیم شده اند. مسمومیت های غذایی به علت مصرف سموم شیمیایی یا سموم بیولوژیکی به وجود می آیند. سموم بیولوژیکی به طور طبیعی در بعضی حیوانات و گیاهان وجود دارند و یا اینکه به صورت متابولیت های سمی از میکروارگانیسم ها ترشح می شوند(22).

مسمومیت های غذایی باکتریایی [3]به بیماریهای با منشا غذایی گفته می شود که عامل آن سم باکتریایی تولید شده در مواد غذایی است. عفونت های غذایی باکتریایی ^[4] به آن دسته از بیماریهای با منشا غذایی گفته می شود که عامل آن ورود باکتری ها به بدن از طریق مصرف مواد غذایی آلوده است، که بدن انسان در برابر حضور آن ها یا متابولیت های آن ها از خود عکس العمل نشان می دهد(22).

عفونت هایی که در آن ماده غذایی محیطی برای رشد پاتوژن محسوب می شود که در این صورت تعداد پاتوژن ها زیاد شده و احتمال عفونت مصرف کننده افزایش می یابد. این پاتوژن ها شامل گونه های سالمونلا، ویبریوپاراهمولیتیکوس و اشریشیاکلی انتروپاتوژنیک هستند(22).

1-1-3 . سالمونلا به عنوان بیماری عمده ناشی از غذا

بیماری های ناشی از غذا نتیجه فروبردن انواع زیادی از آلوده کننده های مواد غذایی یا میکروارگانیسم های پاتوژن، توکسین های میکروبی و شیمیایی است(56). بیماری های ناشی از غذا به عنوان یک تهدید جهانی سلامت عمومی باقی ماندند، رایجترین آن ها سالمونلا است که به عنوان یکی از باکتری های اولیه پاتوژنی ناشی از غذا با اهمیت برای انسان ها مورد توجه است(63). سالمونلوسیس یکی از بیماری های عمده ناشی از غذا در سرتاسر جهان است(56). برخی از سروتیپ ها مثل سالمونلا تایفی و پاراتیفی همچنین پاتوژن های ناشی از غذا هستند که بیماری سیستمیک تب تیفوئید و تب پاراتیفوئید ایجاد می کنند. گسترش آن ها عمدتا به وسیله مواد غذایی و آب آلوده شده به وسیله مدفوع بیماران و حاملین میکروب است(56).

1-1-4 . تخم مرغ و محصولات غذایی حاوی تخم مرغ عمده ترین انتقال دهنده باکتری سالمونلا

پوست تخم مرغ خام و محتویات آن به عنوان منابعی از سالمونلا شناخته شده اند. آنالیز 55 مسمومیت غذایی سالمونلا نشان می دهد که مهم ترین فاکتور شرکت کننده در شیوع سالمونلوسیس، شامل مواد غذایی خام آلوده شده (تخم مرغ)است(56).

به علت آسیب پذیر بودن سالمونلا در برابر حرارت عفونتهای سالمونلا انتریتیدیس ناشی از غذا مکررا وابسته شده به مصرف تخم مرغ های خام و مواد غذایی حاوی تخم مرغ خام مثل بیسکویت، مایونز، بستنی خانگی، پاستا، سس ها(56).

طبق گزارش دپارتمان بهداشت محیط و غذا هنگ کنگ [5] تخم مرغ و محصولات تخم مرغ از مهمترین ایجاد کننده های شیوع مسمومیت های غذایی سالمونلایی است که برای 3% تعداد کل موارد تایید شده سالمونلوسیس محاسبه می شود (56).

براساس داده های فراهم شده به وسیله دپارتمان سلامتی [6] ، 252 مورد شیوع مسمومیت های غذایی رخ داده در سالهای 2002تا 1998 توسط سالمونلا تایید شده است. تخم مرغ و محصولات تخم مرغ (شامل دسر ها) به عنوان مواد غذایی درگیر کننده در90 مورد(36%) از 252 مورد (شامل 415 )نفر شناسایی شدند. آنالیز های بیشتر مشخص می کند که 55 مورد از 90 مورد(61%) به وسیله مصرف دسرها ایجاد شدند. دسرها از مهم ترین انواع غذا ها هستند که موجب شیوع مسمومیتهای غذایی توسط سالمونلا می شوند(56).

دسر ها شامل هر چیز شیرین که مطابق نقل قول ها بعد از صرف غذا(نهار و یا شام) خورده می شوند. این مواد غذایی به خاطر منفعت آن ها در سال های اخیر زیاد استفاده میشوند. و تخم مرغ ها اغلب به عنوان یک جزء ترکیبی در دسر ها استفاده می شوند و پاتوژن های ویژه ای که وابسته به تخم مرغ مثل سالمونلا ممکن است به آن ها وارد شوند و باعث به خطر افتادن سلامتی شوند. مخصوصا برای مواد غذایی که ترکیبات آنها بر پایه تخم مرغ است و مرحله ویژه ای(مثل فرآوری حرارتی) برای کاهش پاتوژن ها وجود ندارد،در میان 55 مورد مسمومیت ها، ترامیسا [7] نوعی دسر ایتالیایی و دسر حاوی آرد برنج و تخم مرغ یا پودینگ ها [8] به عنوان ایتم های مواد غذایی درگیر کننده در 21 و 25 مورد شیوع شناسایی شدند. ترامیسا و پودینگ بدون عمل آوری حرارتی، نوعی دسر است که حاوی ذرات تخم مرغ خام است و بدون هیچ مرحله کاهش پاتوژنها مثل فرآوری حرارتی تهیه می شود. مهم ترین فاکتورهای درگیر کننده این موارد، مصرف مواد غذایی خام (تخم مرغ) و رعایت ناچیز بهداشت شخصی حمل کننده های مواد غذایی است(56). درجدول زیر شیوع مسمومیت های غذایی سالمونلایی ناشی از مصرف تخم مرغ و محصولات تخم مرغ(دسرها)از 2002-1998نشان داده شده است(56).

[1]. poisoning

[2]. Infections

[3]. Bacterial Food intoxication

[4]. Bacterial Food infection

[5]. HKSAR

[6]. DH

[7]. tiramisu

[8]. pudding