بررسی میزان بقاء لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 ریزپوشانی شده توسط صمغ فارسی (زدو) در ماست و در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی

بررسی میزان بقاء لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 ریزپوشانی شده توسط صمغ فارسی (زدو) در ماست و در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی

چکیده

تحقیقات نشان داده است که اکثر مواد‌غذایی پروبیوتیکی حتی زمانی که در دماهای پایین نگهداری می‌شوند تعداد پروبیوتیک‌های آن‌ها کم می‌شود و این امر باعث می­شود تعداد آنها در زمان مصرف کمتر از حد لازم باشند (CFU/g10⁷). روش­های مختلفی برای افزایش مقاومت باکتری­های حساس پروبیوتیک پیشنهاد شده که از آن جمله می‌توان به ریز‌پوشانی اشاره کرد. در تحقیق حاضر، سلول­های سویه­ی بومی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 که یک پروبیوتیک شناخته شدهاست، توسط صمغ فارسی و به روش امولسیون دوگانه پوشش داده شد و در بستر ماست اضافه شد. خصوصیات ظاهری این ریزپوشینه­ها توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرارداده شد. میزان بقاء این باکتری به دو صورت آزاد و پوشش داده شده با صمغ فارسی در بستر ماست و به صورت جداگانه در مدت 21 روز نگهداری در دمای 4 درجه سانتی­گراد بررسی شد. طی این مدت تغییرات pH واسیدیتهنمونه­ها، خواص حسی، ویسکوزیته و سفتی نمونه­­های ماست حاوی سلول‌های پوشش داده شده و آزاد نیز مورد بررسی قرار گرفت. در انتهای دوره­ی نگهداری مشخص شد که اثر ریزپوشانی بر زنده مانی باکتری­ها معنی­دار بوده است (05/0p<). در نمونه­ی حاوی میکروب ریزپوشانی شده با صمغ فارسی طی 21 روز انبارمانی در یخچال تنها 8/0 سیکل لگاریتمی از تعداد میکروب وارد شده کاهش پیدا کرده بود و تعداد هنوز بیشتر از CFU/g10⁷ بود. در شرایط شبیه­سازی شده گوارش نیز اختلاف معناداری بین سلول ریزپوشینه و آزاد وجود داشت.pHو اسیدیته تمامی نمونه­ها تغییر معنی‌داری در روزهای اولیه داشت. میزان ویسکوزیته در طول زمان نگهداری کاهش پیدا کرد و در همین مدت زمان، سفتی بافت افزایش پیدا کرد. خواص حسی نمونه ماست حاوی پروبیوتیک ریزپوشانی­شده دارای اختلاف معنی‌داری با نمونه شاهد بود. به طور کلی نتایج این پژوهش، روش امولسیون دوگانه و صمغ فارسی را پوشش دهنده­ مناسبی برای باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7در بستر ماست معرفی کرد و مشخص شد که این روش می­تواند از جمله راهکارهایی برای افزایش بقاء این باکتری در نظر گرفته شود.

کلمات کلیدی: لاکتوباسیلوس پلانتارومA7، پروبیوتیک،‌ریزپوشانی، امولسیون دوگانه، صمغ فارسی، ماست، محیط شبیه­سازی شده گوارشی

فهرست مطالب

عنوان صفحه

فصل اول:مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه و اهمیت موضوع2

1-2- تعریف مسئله4

1-3- اهداف5

1-4- فرضیات5

فصل دوم:بررسیمنابع

2-1- غذاهای فراسودمند8

2-2- فراورده های غذایی فراسودمند حاوی میکروب‌های پروبیوتیک8

2-3- ماست پروبیوتیک9

2-4- پروبیوتیک‌ها10

2-4-1- معیار انتخاب میکروارگانیسم به عنوان پروبیوتیک11

2-4-2- اثرات سودمند پروبیوتیک‌ها12

2-5- گونه‌های شناخته شده پروبیوتیک‌ها14

2-5-1- گونه لاکتوباسیلوس پلانتاروم15

2-5-2- لاکتوباسیلوس پلانتاروم A715

2-6- فرایند ریزپوشانی16

2-6-1- ریزپوشانی پروبیوتیک‌ها19

2-6-2- ساختمان ریزپوشینه20

2-6-3- انواع روش‌های ریزپوشانی21

2-6-4- استفاده از روش امولسیون به منظور ریزپوشانی پروبیوتیک‌ها23

2-6-5-کاربرد امولسیون‌های چند گانه در توسعه مواد غذایی سالم25

فهرست مطالب

عنوان صفحه

2-6-6- کاربرد امولسیون دوگانه در ریزپوشانی میکروارگانیسم‌ها26

2-6-7- سورفاکتانت‌ها27

2-7- مواد مصرفی برای ریزپوشینه‌دار کردن29

2-7-1- صمغ‌های ژلان و زانتان29

2-7-2- ژلاتین30

2-7-3- نشاسته30

2-7-4- کاراگینان30

2-7-5- سلولز استات فتالات31

2-7-6- کیتوزان31

2-7-8- آلژینات31

2-7-9- صمغ فارسی32

2-8- مروری بر تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی بقاء باکتری‌های پروبیوتیک ریزپوشینه شده طی نگهداری در ماست34

2-9- مروری بر تحقیقات انجام شده در زمینه ارزیابی میزان بقاء باکتری‌های پروبیوتیک ریزپوشانی شده نسبت به شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی35

2-10- هدف از انجام پژوهش37

فصل سوم:مواد وروش‌ها

3-1- معرفی تجهیزات، موادو میکروارگانیسم‌های مورد استفاده40

3-1-1- تجهیزات مورد استفاده40

3-1-2- مواد شیمیایی41

3-1-3- میکروارگانیسم مورد استفاده43

فهرست مطالب

عنوان صفحه

3-2- عملیات میکربی44

3-2-1- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک44

3-2-2- آزمون‌های بیوشیمیایی به منظور شناسایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A745

3-3- آنالیز شیمیایی شیرخشک بدون چربی و صمغ فارسی46

3-3-1- اندازه‌گیری خاکستر46

3-3-2- اندازه‌گیری رطوبت و ماده خشک46

3-3-3- اندازه‌گیری چربی47

3-3-3-1- روش سوسکله47

3-3-3-2- روش ژربر47

3-3-4- اندازه‌گیری پروتئین و ازت کل47

3-3-5- اندازه‌گیری اسیدیته برحسب اسید لاکتیک48

3-5- رسم منحنی رشد48

3-6- تهیه سوسپانسیون فعال سلولی جهت ریزپوشانی49

3-7- فرایندهای ریزپوشانی49

3-8- آنالیز رهایش سلول‌ها از ریزپوشینه‌ها50

3-9- محاسبه‌ی بازده فرایند ریزپوشانی50

3-10- بررسی مورفولوژی ریزپوشینه‌ها توسط میکروسکوپ نوری51

3-11- تهیه‌ی ماست پروبیوتیک و ارزیابی خصوصیات میکروبیولوژیکی، فیزیکی و حسی نمونه‌های ماست51

3-11-1- تهیه ماست پروبیوتیک51

3-11-2- آزمون‌های انجام شده بر روی ماست53

3-11-3- ارزیابی میزان بقا پروبیوتیک‌ها درطول دوره نگهداری ماست54

فهرست مطالب

عنوان صفحه

3-12- بررسی میزان بقاء سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده در محیط شبیه‌سازی شده گوارشی54

3-13- آماده‌سازی عصاره‌های شبیه‌سازی شده گوارشی55

3-14- ارزیابی پایداری سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی55

3-15- ارزیابی حسی55

3-16- آنالیز آماری داده‌ها56

فصل چهارم:نتایج وبحث

4-1- آزمون‌های بیوشیمیایی58

4-2- آزمون‌ها و بررسی‌های شیمیایی62

4-2-1- شیرخشک62

4-2-2- صمغ فارسی63

4-3- منحنی رشد باکتری لاکتوباسیلوس پلانتارومA764

4-4- فرایندهای ریزپوشانی و پوشش‌دهی65

4-4-1- شکل ریزپوشینه‌های تولید شده65

4-5- میزان بقاء سلول‌های ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در طی دوران نگهداری در دمای 4 درجه سانتی گراد66

4-6- میزان بقا سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست در طول نگهداری67

4-7- نتایج ارزیابی مقاومت سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست، قبل و بعد از افزودن به ماست در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی70

4-8- ارزیابی آزمون های شیمیایی ماست طی زمان نگهداری74

4-8-1- تغییرات pH74

فهرست مطالب

عنوان صفحه

4-8-2- تغییرات اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک در نمونه‌های ماست75

4-9- ارزیابی آزمون‌های فیزیکی و کیفی ماست طی زمان نگهداری77

4-9-1- تغییرات گرانروی77

4-9-2- تغییرات سفتی و نفوذ ناپذیری بافت ماست78

4-10- ارزیابی خصوصیات حسی ماست79

فصل پنجم:نتیجه‌گیری

5-1- جمع بندی نتایج کلی82

5-2- پیشنهادات83

منابع86

فهرست جدول‌ها

عنوان صفحه

جدول 2-1- تعاریف مختلف ارائه شده پروبیوتیک در گذر زمان13

جدول 2-2- باکتری‌های لاکتیک اسید پروبیوتیک15

جدول 2-3- انواع روش‌های ریزپوشانی22

جدول 3-1- اجزای سازندهی محیط کشت MRS مایع42

جدول 3-2- جدول نظرسنجی خصوصیات حسی نمونه‌های ماست56

جدول 4-1- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A759

جدول 4-2- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم60

جدول 4-3- مشخصات ظاهری پرگنه و سلول‌ باکتری باکتری لاکتوباسیلوس پلانتارومA761

جدول 4-4- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی مشخصات ظاهری پرگنه سویه‌های آغازگرها61

جدول 4-5- نتایج آزمون‌های شیمیایی شیرخشک62

جدول 4-6- نتایج آزمون‌های شیمیایی صمغ فارسی63

جدول 4-7- نتایج آزمون های شیمیایی نمونه‌های ماست63

جدول 4-8- ریزپوشانی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 برروی بقای سلول‌ها در زمان نگهداری در دمای 4 درجه در مدت 21 روز66

جدول 4-9- بقا سلول‌های آزاد و ریزپوشینه شده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست طی دوران نگهداری در مدت 21 روز67

جدول 4-10- بقا تیمارهای مختلف لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 قبل و بعد از قرارگرفتن در شرایط اسیدی (hr24)71

جدول 4-11- بقا تیمارهای مختلف لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 قبل و بعد از قرارگرفتن در شرایط صفراوی (hr24)71

جدول 4-12- تغییرات pH نمونه‌های ماست در مدت زمان انبارمانی74

فهرست جدول‌ها

عنوان صفحه

جدول 4-13- تغییرات اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک نمونه‌های ماست در مدت زمان انبارمانی76

جدول 4-14- ویسکوزیته ظاهری (سانتیپوز) نمونه‌های ماست در مدت زمان انبارمانی77

جدول 4-15- سفتی (گرم) لخته ماست در مدت زمان انبارمانی78

جدول 4-16-مقایسه میانگین خواص ارگانولپتیک نمونه‌های ماست79

فهرست شکل‌ها

عنوان صفحه

شکل 2-1- جزیئات ساختاری ریزپوشینه­ها21

شکل 2-2- تصویر شماتیک از ساختار امولسیون دوگانه23

شکل 2-3- ساختمان آلژینات32

شکل 3-1- فرایند تولید ماست52

شکل 4-1- منحنی رشد لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در محیط کشت MRS64

شکل 4-2- تصویر حاصل از میکروسکوپ نوری (400×) ریزپوشینه­های تولیدی توسط امولسیون دوگانه65

فصل اول

مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه و اهمیت موضوع

نقش ترکیبات فعال رژیم غذایی در تغذیه انسان، یکی از مهم­ترین مسائل مورد توجه و تحقیق در زمینه علم تغذیه است. یافته­های پژوهشی در مورد این موضوع، پیامدهای گسترده­ای برای مصرف‌کنندگان، مسئولان بهداشتی، متخصصان تغذیه و هم­چنین تولیدکنندگان، فرآیندکنندگان و توزیع­کنندگان موادغذایی داشته است. شواهد علمی جدید در مورد فواید و خطرات مرتبط با جنبه­های منحصر به فرد ترکیبات رژیم­غذایی، به طور مداوم در حال ظهور و پیشرفت می­باشند. اثرات بالقوه مواد مغذی و اجزای دیگر در رژیم­غذایی، منجر به تحقق ایده تولید مواد غذایی با ویژگی­های خاصی شده است که فراتر از برآوردن نیازهای اساسی تغذیه­ای، بر عملکرد بدن نیز مؤثر باشند. این عامل توجیه­کننده­ی علاقه­ی زیاد مردم به غذاهای فراسودمند[1] است (بورگاین و همکاران، 2006).

موادغذایی که به طور رضایت­بخشی باعث بهبود وضعیت سلامت و یا کاهش خطر ابتلا به بیماری­ها، می­شوند را غذاهای فراسودمند می نامند. این محصولات در حال حاضر، بازار رو به رشدی داشته و یکی از زمینه­های اصلی فعالیت در تولید محصولات جدید است. از آن­جایی که مصرف‌کنندگان بیش از پیش به دنبال غذاهای سالم با ارزش­ بالاتری هستند، محصولات موفق­تر آنهایی هستند که می­توانند ادعا کنند دارای فواید سلامتی­بخش بیشتری هستند. از آنجا که اثرات مفید مواد غذایی تابعی از ترکیبات فعال در رژیم غذایی (اجزای فراسودمندا) می­باشد، طراحی و توسعه این غذاها نیاز به روش­هایی برای تعریف و بهینه­سازی حضور آنها دارد، چه با افزایش سهم ترکیبات اولیه با اثرات مفید و چه با محدود کردن ترکیباتی که دارای پیامدهای منفی برای سلامتی هستند.

از گذشته غذا نه تنها به عنوان عامل تامین­کننده انرِژی بدن انسان بوده است بلکه به عنوان عاملی برای افزایش سلامت مصرف­کننده نیز، مورد استفاده قرار می­گرفته است. بنابراین، امروزه تحقیقات علم تغذیه، در مواردی از جمله دریافت بهینه مواد مغذی، شناسایی اجزای با کیفیت در ترکیبات موادغذایی و توسعه غذاهایی جدید با عملکرد جدید که همان نقش ترکیبات غذایی در پیشگیری از بیماری­ها با تعدیل سیستم­های فیزیولوژیکی است، توسعه یافته است.

اولین تعریف غذاهای فراسودمند را به بقراط نسبت می­دهند با شعار غذا را داروی خود کنید (ریاض. م، 1999). بعد از آن اولین بار در سال 1980، ژاپن غذاهایی را که با هدف ارتقاء سلامت مصرف­کننده تولید و فراوری می‌شد، فراسودمند نامید (شاه و همکاران، 2000). امروزه غذاهای فراسودمند به صورت زیر تعریف می­شوند،محصولات غذایی که علاوه بر ارزش تغذیه­ای معمول، مزایای خاص دیگری هم برای سلامتی دارند و یا غذاهایی که حاوی سطوحی از ترکیبات زیست فعال می­باشند که به ارزش غذایی معمول محصول اضافه می­کنند (نازار و همکاران، 2009).

این روزها مردم علاقه به مصرف غذاهای سالم­تر، بدون تغییر اساسی در رژیم غذایی خود دارند. این بی­علاقگی مصرف­کنندگان نسبت به تغییر عادات غذایی پیشنهاد می­دهد که بازار بالقوه­ای برای غذاهایی وجود دارد که ارزش تغذیه­ای آنها عوض شده است، ولی خواص حسی آنها تغییر نکرده است (ریاض و همکاران، ‌1999). علاوه بر این علاقه مردم به مصرف غذاها و یا مکمل­های غذایی که به بهبود میکروفلور روده کمک می­کند، بیشتر شده است (ساندوال و همکاران، 2010). در این میان غذاهای پروبیوتیک مهم­ترین غذاهای ارتقاء دهنده سلامت مصرف­کننده می­باشند و در سال­های اخیر آگاهی مردم نسبت به اینکه مصرف پروبیوتیک­ها اثرات مفیدی بر سلامتی دارد، افزایش یافته است (چمپاجن و همکاران، 2007). استفاده از پروبیوتیک­ها در غذاهای فراسودمند و صنایع دارویی رشد زیادی داشته است، به طوری­که 65 درصد از بازار غذاهای فراسودمند را به خود اختصاص داده‌اند (آگوست، 2006). موادغذایی نسبت به داروها حامل بهتری برای پروبیوتیک­ها محسوب می­شوند زیرا مصرف­کنندگان تمایل بیشتری به مصرف غذاهای سودمند نسبت به داروها دارند و غذای پروبیوتیک ارزش غذایی بیشتری نسبت به داروی حاوی پروبیوتیک دارد.

باکتری­های پروبیوتیک به این صورت تعریف می­شوند؛ میکروارگانیسم­های زنده­ی غیر بیماریزایی، که وقتی به مقدار کافی مصرف شوند اثرات مفیدی بر سلامت میزبان (که می­تواند انسان یا دام باشد) خواهند داشت (دلا پورتا و همکاران، 2012؛ پیکوت و همکاران، 2000). امروزه محصولات پروبیوتیکی از قبیل سویا، آب­پرتقال، محصولاتی بر پایه­ی غلات و حتی شکلات پروبیوتیک در بازار عرضه می­شوند (رودگرز. س، 2011).

عواملی موجب کاهش زنده­مانی پروبیوتیک­ها در موادغذایی می­باشند مثلpH نامطلوب، دما، پتانسیل اکسیداسیون - ­احیا و تولید هیدروژن پراکسید (چاواری و همکاران، 2010؛ آلان و همکاران، 2010)، در نتیجه در بسیاری از محصولات به هنگام مصرف تعداد باکتری به اندازه مطلوب باقی نمانده است. هم­چنین اسید معده و قلیای روده هم در زنده­مانی باکتری­ها موثر است (کاپلا و همکاران، 2007). روش­های مختلفی برای افزایش مقاومت باکتری­های پروبیوتیک حساس پیشنهاد شده از جمله آنها می­توان به انتخاب سویه­های مقاوم به اسید معده، استفاده از بسته­بندی غیر­قابل­نفوذ به اکسیژن یا استفاده از موادی که اکسیژن را مصرف می­کنند مثل آسکوربیک اسید، ایجاد سازش با استرس، دو مرحله­ای کردن تخمیر (اگر محصول تخمیری است)، الحاق باکتری به ریزمغذی­ها مثل اسیدهای آمینه و پپتید­ها و ریزپوشانی اشاره کرد (آلان و همکاران، 2010).

ریزپوشانی[2] فرایندی است که سلول­ها در شبکه ریزپوشینه یا در یک غشا قرار می­گیرند. یک ریزپوشینه شامل غشایی نفوذ ناپذیر یا نیمه نفوذپذیر، کروی، نازک و محکم است که اطراف هسته­ی مایع/جامد را پوشانده است که قطر آن بین یک میلی­متر تا چند میکرون متغیر است. پلیمر­های غذایی مثل آلژینات، کیتوزان، کربوکسی متیل سلولز، کاراگینان، ژلاتین و صمغ­ها از جمله صمغ فارسی و صمغ عربی به طور عمده و با روش­های مختلف در ریزپوشانی استفاده می­شوند. چون جمعیت سلول­ها طی فرایند ریزپوشانی تحت تاثیر قرار می­گیرد، ضروری است که اطمینان حاصل شود که تکنیک ریزپوشانی تاثیر منفی بر جمعیت سلولی ندارد.

یک روش جایگزین برای حفاظت از باکتری­های پروبیوتیک وارد کردن آنها به امولسیون آب در روغن در آب است. امولسیون دوگانه احتمالا محافظ مناسبی برای باکتری­ها هنگام عبور آنها از محیط معده است و به عنوان کپسولی زیستی[3] برای ریزپوشانی باکتری­ها برای مصارف صنعتی در صنعت لبنیات استفاده می­شود (گنزالس و همکاران).

1-2- تعریف مسئله

با توجه به نقش ریزپوشانی در افزایش بقاء میکروارگانیسم­ها، و با در نظر گرفتن اینکه محصولی پروبیوتیک است که به تعداد لازم (cfu/ml10⁷) به سلول­های اپیتلیال روده برسد، نشان از وجود لزوم پرداخت به این موضوع است و سوالات زیر در ذهن تداعی می­شود:

1. آیا فرایند ریزپوشانی توسط زدو باعث حفظ و نگهداری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7در ماست می‌شود؟
2. آیا فرایند ریزپوشانی توسط زدو باعث حفظ و نگهداری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7در محیط شبیه­سازی شده گوارشی می­شود؟

1-3- اهداف

یکی از اهداف این تحقیق بررسی اثر محافظت­کننده­ی ریزپوشینه­های آماده شده به روش امولسیونی آب در روغن در آب صمغ فارسی بر زنده­مانی باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7[4] در بستر ماست و نگهداری امولسیون بدون اضافه کردن به ماست در دمای C˚4 است. در این تحقیق برای اولین بار اثر محافظت­کنندگی ریزپوشینه­های تولید شده با استفاده از صمغ فارسی بر زنده­مانی باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در بستر ماست و شرایط شبیه­سازی شده گوارشی مورد بررسی قرار گرفته است.

1-4- فرضیات

در این پروژه دو فرضیه مدنظر می­باشد:

1. ترکیباتی که به عنوان پوشش برای ریزپوشانی مورد استفاده قرار می­گیرند، می­توانند با محافظت از باکتری سبب افزایش مقاومت باکتری در ماست شوند.
2. ترکیباتی که به عنوان پوشش برای ریزپوشانی مورد استفاده قرار می­گیرند، می­توانند با محافظت از باکتری سبب افزایش مقاومت باکتری در محیط­های شبیه­سازی شده گوارشی شود.

فصل دوم

بررسی منابع

2-1- غذاهای فراسودمند[5]

در دنیای امروز، مصرف­کنندگان غذا را فراتر از طعم و ارزش تغذیه­ای می­دانند و به عنوان عاملی که دارای فواید مشخص برای سلامتی­شان است، در نظر می­گیرند. از همین­رو مبحث غذاهای فراسودمند مطرح شده است (آنال و همکاران، 2007).

به طور کلی غذاهای فراسودمند باید دارای دو دسته مواد، شامل مواد مغذی پایه[6] و مواد فعال از نظر فیزیولوژیکی باشند. دسته دوم جزئی است که به منظور فراسودمندکردن غذا به آن افزوده می­شود، که می­تواند به اشکال مختلفی از قبیل درشت مغذی مثل نشاسته، ریز مغذی مثل ویتامین­ها، غیر مغذی مثل میکروارگانیسم­های زنده یا فاقد ارزش غذایی مثل الیگوساکاریدها باشد (رابرفروید. م، 200). در سال­های اخیر، با افزایش سطح آگاهی مردم در رابطه با اثر بخشی غذاهای فراسودمند، بخش عمده‌ای از بازار غذا به این گروه اختصاص یافته است.

در کل غذاهای فراسودمند به دو شکل تولید می­شود:

1-اجزاء مورد استفاده در غذاهای فراسودمند از منابع طبیعی تغلیظ و جداسازی شده باشند و سپس به منظور تولید فراورده­های غذایی فراسودمند جدید، به آنها افزوده شود.

2-سطح ترکیبات فراسودمند موجود در یک ماده غذایی را تا حد تاثیرگذار، افزایش می­دهند (سیبل. ا، 2007).

2-2-­ فراورده­های غذایی فراسودمند حاوی میکروارگانیسم­های پروبیوتیک

برخی غذاهای فراسودمند با هدف بهبود تعادل و فعالیت فلور میکروبی روده تولید می­شوند که غذاهای حاوی میکروارگانیسم­های پروبیوتیک[7] نام دارند (موسیلهی. س، 2003).

معمولا پروبیوتیک­ها به صورت طبیعی در غذا وجود ندارند و زمان زیادی است که این میکروارگانیسم­ها به صورت مکمل­های خوراکی، به منظور پیشگیری یا درمان بیماری­ها مورد مصرف قرار می­گیرند و در سال­های اخیر ایده افزودن میکروارگانیسم­های پروبیوتیک به موادغذایی مطرح شده است.

به صورت کلی مواد غذایی نسبت به داروهای مکمل گزینه مناسب­تری برای رساندن باکتری­های پروبیوتیک به بدن انسان به شمار می­روند، به دلایلی از جمله اینکه مردم به مصرف غذاهای حاوی میکروارگانیسم­های پروبیوتیک بیشتر از داروهای مکمل تمایل نشان می­دهند و اینکه کیفیت تغذیه­ای این غذاها بیشتر از قرص­های حاوی پروبیوتیک است. هم­چنین ترکیبات سازنده مواد غذایی پایداری میکروارگانیسم­های پروبیوتیک در دستگاه گوارش را بالاتر می­برد(ووقان و همکاران، 1999).

2-3-­ ماست پروبیوتیک

تخمیر یکی ار قدیمی­ترین روش­هایی است که جهت تبدیل شیر به محصولاتی با عمر انبارمانی بالاتر انجام می­شود. پیداکردن منشإ دقیق پیدایش شیرهای تخمیر شده مشکل است ولی تاریخ آن به 10 الی 15 هزار سال پیش بر می­گردد. در آن زمان شیوه زندگی انسان از حالت جمع­آوری خوراک به حالت تولید غذا تغییر یافت (پدرسون. س، 1979). اگرچه هیچ نوشته­ای راجع به منشأ ماست وجود ندارد ولی اثرات سلامتی­بخش و تغذیه­ای آن در بسیاری از تمدن­ها از مدت­ها پیش وجود داشته و به احتمال زیاد منشأ آن به خاورمیانه بر می­گردد. سیر تکاملی این محصول تخمیر شده طی گذشت زمان، با مهارت­های آشپزخانه­ای مردمان چادرنشین در سراسر جهان انجام گرفته است و امروزه محصولات شیری تخمیر شده در بسیاری از کشورها در مقیاس وسیع تولید می­شود، اگرچه تعداد کمی از آنها شکل تجاری به خود گرفته­اند(تمیم و همکاران، 2000).

در تولید تجاری ماست، مخلوطی از باکتری­های اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس ­دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس[8] و استرپتوکوکوس ترموفیلوس[9]، به شیر تولید می­شود.

طی تخمیر ماست برخی از متابولیت­های میکروبی بهبود دهنده طعم و خصوصیات سلامتی­بخش نیز تولید می­شوند. چنین ویژگی­هایی با غنی­سازی ماست به وسیله باکتری­های پروبیوتیک افزایش می‌یابد. لاکتوباسیلوس­ها و بیفیدوباکتریوم­ها[10] در محصولاتی مانند ماست باعث تسهیل جذب پروتئین شده و با کاهش pH معده یونیزاسیون مواد معدنی را تشدید کرده و جذب املاحی مانند کلسیم، روی، آهن و فسفر را افزایش می­دهند (گمز و همکاران، 1999).

ماست یکی از بهترین بسترهای غذایی برای وارد کردن پروبیوتیک است.­ رشد ضعیف کشت­های پروبیوتیک در شیر و نقص فراورده­های نهایی از نظر خواص حسی ماست، باعث شد تا همزمان از کشت­های سنتی و پروبیوتیک استفاده کنند. تولید مقادیر قابل توجهی اسید استیک طی دوران گرمخانه­گذاری طولانی توسط بیفیدوباکتریوم­ها ایجاد عطر و طعم پنیری در ماست در اثر فعالیت سویه­های پروتئولیتیک پروبیوتیک و عدم تولید حداقل مقدار استالدهید لازم جهت ایجاد طعم ویژه ماست، از مهم­ترین نقص­های ماست­های تولید شده با کشت­های پروبیوتیک هستند (گرادی و همکاران، 2005). بهترین راه برای بهبود طعم فراورده­های پروبیوتیک، استفاده از میکروارگانیسم­های پروبیوتیک به عنوان کشت همراه[11] با کشت­های آغازگر اصلی ماست است (طاهری و همکاران، 1388)، زیرا کشت­های آغازگر با تولید آمینواسیدها و کاهش پتانسیل اکسیداسیون - ­احیا، رشد باکتری­های پروبیوتیک را بهبود می­بخشند و با تولید ترکیبات موثر بر عطر و طعم، مشکلات احتمالی عطر و طعم را برطرف می­کنند (گمز و همکاران، 1999).

انتشار گزارش­هایی مبنی بر عدم تحمل سویه­های آغازگر ماست در سیستم گوارشی، باعث شده است تا پروبیوتیک­های انسانی از میان میکروارگانیسم­های غیربیماری­زا که زیستگاه آنها اندام­های گوارشی انسانی می­باشد،‌ جداسازی و گزینش شوند که گروه عمده­ای از آنها را لاکتوباسیلوس­ها تشکیل می­دهند. کاربرد موفقیت­آمیز این گروه از میکروارگانیسم­ها در فراورده­های تخمیری،‌ به خصوص ماست، به مراتب گزارش شده است (میرلوحی و همکاران، ‌1388).

2-4- پروبیوتیک­ها

نخستین ­بار واژه پروبیوتیک در سال 1965 توسط لیلی[12] و استیلون[13]، به معنای حیات­بخش از واژه یونانی پروبیوتیس گرفته شده است و از پروبیوتیک به معنای تشریح مواد تقویت کننده­ی رشد مترشحه از میکروارگانیسم­ها، که باعث تحریک رشد سایر میکروارگانیسم­ها می­شوند، استفاده کردند. بنابراین تعریف پروبیوتیک از نظر مفهوم، نقطه مقابل آنتی­بیوتیک­ها یا عوامل ضد حیات است (گمز و همکاران، 1999). بعدها توسط افرادی چون پارکر[14] (1974) و فولر[15] (1976) تغییر یافت و دستگاه گوارش به عنوان نقطه اثر پروبیوتیک­ها معرفی شد (وجدانی و همکاران، 1382). این تعاریف با تعاریف قبلی که بر روی اثرات متقابل پروبیوتیک­ها ومیکروفلور روده تمرکز کرده بود،‌ متفاوت است. ساده­ترین تعریف برای پروبیوتیک­ها توسط فولر ارائه شد که پروبیوتیک­ها را میکروب­های زنده­ای معرفی کرد که بر میزبان اثرات سودمندی باقی می­گذارد، به این صورت که تعادل میکروبی روده را بهبود می­بخشند. اخیرا FAOو سازمان بهداشت جهانی[16]، پروبیوتیک­ها را اینطور تعریف کردند: میکروارگانیسم­های زنده­ای هستند که وقتی به مقدار کافی یا در محلی خاص مصرف می­شوند یک یا چندین فایده مشخص را برای سلامتی میزبان (که می­تواند انسان یا دام باشد) به همراه دارند. این میکروارگانیسم­ها باید از نظر متابولیکی در محصول ثابت و فعال باقی بمانند و قبل از هضم زنده مانده و بتوانند خود را به سلول­های اپیتلیال روده برسانند و آثار سودمندی را در آن قسمت به جای گذارند (آنال و همکاران، 2007). پروبیوتیک محدوده­ی گسترده­ای از میکروارگانیسم­ها را شامل می­شود که اکثرا باکتری هستند، اما بعضی مخمر­ها هم پروبیوتیک محسوب می­شوند (بورگین و همکاران، 2011؛ پیکوت و همکاران، 2007).

البته طی زمان­های مختلف تعاریف متعددی برای پروبیوتیک­ها ارایه شده که در جدول 2-1 به بعضی از آن­ها اشاره شده است (ویدهالاکشمی و همکاران، 2009).

2-4-1-­ معیار انتخاب میکروارگانیسم به عنوان پروبیوتیک

میکرارگانیسم­هایی که به عنوان پروبیوتیک انتخاب می­شوند دارای یک­سری ویژگی­هایی هستند. از جمله این ویژگی­ها عبارتند از (گمز و همکاران، ‌1999؛ گراجک و همکاران، 2005؛ ماتیلا-سندهلما، 2002):

-­ بیماری­زا نباشد و در بدن میزبان مسمومیت ایجاد نکند و نسبت به آنتی­بیوتیک­ها مقاوم باشد.

-­ باید از سویه­ی مشخص بوده و منشا انسانی داشته باشد.

-­ برای مصارف انسانی توانایی زنده­مانی در محصول را داشته و بتواند شرایط تولید ماده غذای را تحمل کند و پایدار باشد.

-­ از نظر ژنتیکی پایدار باشد.

-­ نسبت به اسید معده، ترکیبات صفراوی و آنزیم­های گوارشی مقاوم بوده و قابلیت اتصال به سلول­های اپیتلیال روده را داشته باشد.

قابل ذکر است که ویژگی­های عملکردی میکروارگانیسم، مهم­تر از منشا پروبیوتیک بودن آن است.

2-4-2-­ اثرات سودمند پروبیوتیک­ها

اثرات مفید پروبیوتیک­ها شامل کاهش شیوع اسهال، یبوست و سرطان روده، تنظیم سطح کلسترول، بهبود سوءهاضمه، بهبود سیستم ایمنی و رقابت با پاتوژن­ها است. پروبیوتیک­ها از رشد میکروارگانیسم­های ناخواسته یا مسموم­کننده­ی غذا مثل سالمونلا نیز جلوگیری می­کنند که این اثرات مفید به دلیل تولید اسیدهای کوتاه­زنجیر (مثل اسید­لاکتیک، اسید­استیک و یا پروپیونیک­اسید) و باکتریوسین است. همچنین این باکتری­ها به رشد باکتری­های مفید موجود در فلور روده نیز کمک می‌کنند (خلیل و همکاران، ‌1998؛ موتوکوماراسامی و همکاران، 2006).

اگر میکروارگانیسم در زمان مصرف به اندازه­ی کافی وجود نداشته باشد که این مقدار معمولاً cfu/ml 10⁶ (موکاران و همکاران، 2009؛ وپیکوت و همکاران، 2004) یا cfu/ml10⁷ است، مزایای حاصل از وجود این میکروارگانیسم­ها به مصرف­کننده نخواهد رسید و اگر محصول خواص حسی مطلوب نداشته باشد، مصرف­کننده آن محصول را مصرف نمی­کند (گوناسکاران و همکاران، 2007). در مورد حداقل تعداد میکروارگانیسم زنده تا زمان مصرف برخی کشورها مثل آرژانتین، پاراگوئه و برزیل این تعداد راcfu/ml 10⁶ برای بیفیدوباکتریوم­ها می­دانند ولی در ژاپن این تعداد cfu/ml 10⁷ است. هم­چنین فدراسیون بین المللی لبنیات[17]، این مقدار را cfu/ml 10⁷ اعلام کرده است (چان و همکاران، 2002؛ چاواری و همکاران، 2010؛ دلا و همکاران، 2012).

جدول 2-1- تعاریف مختلف ارائه شده پروبیوتیک در گذر زمان

منبع	تعریف	سال
ورجین	پروبیوتیک­ها، میکروارگانیسم­های متضاد آنتی­بیوتیک­ها هستند.	1954
لیلی و استیلول	ماده­ای که بوسیله­ی یک میکروارگانیسم ترشح شده و رشد سایرین را تحریک می‌کند.	1965
فوجی و کوک	ترکیباتی که باعث مقاومت میزبان به عفونت می­شوند ولی از رشد میکروارگانیسم­ها در محیط آزمایشگاهی جلوگیری نمی­کنند.	1973
پارکر	مواد و میکرب­هایی که در تعادل میکربی روده شرکت دارند.	1974
هاونار و هوییس اینتولد	یک یا چند نوع میکروارگانیسم زنده که در صورت مصرف توسط انسان یا دام بوسیله­ی بهبود میکروفلور روده به میزبان سود می­رسانند.	1992
شرزمینر و دورس	محصولی که شامل میکروارگانیسم­های زنده­ی مشخص در تعداد معین است و در میکروفلور میزبان تغییرات مثبت ایجاد میکند.	2001
FAO/WHO	میکروارگانیسم­های زنده­ای که زمانی که به تعداد کافی مصرف شوند بر روی میزبان اثرات مفید دارد.	2002

البته موانعی برای زنده­مانی پروبیوتیک­ها در محصول نهایی وجود دارد از جمله pHنامطلوب، دما، پتانسیل اکسایش - ­کاهش و تولید هیدروژن پراکسید (چاواری و همکاران، ‌2010). در نتیجه در بسیاری از محصولات به­هنگام مصرف، تعداد باکتری مورد نظر به تعداد مطلوب باقی نمانده است. همچنین اسید معده و قلیای روده هم در زنده­مانی باکتری­ها موثر است (کاپلا و همکاران، 2007). در نتیجه تقاضای زیادی از صنعت برای تضمین پایداری این میکروارگانیسم­ها در غذا حین نگهداری وجود دارد، زیرا زنده­مانی آن­ها هم از جنبه­ی اقتصادی مهم است (وقتی پایداری بالا باشد به تعداد کمتری میکروارگانیسم اولیه نیاز است) و هم از جنبه­ی سلامتی اهمیت دارد، زیرا هنگامی پروبیوتیک‌ها اثرات سودمند خود را بر میزبان می­گذارند که به تعداد اشاره شده به سلول­های اپیتلیال روده برسند (میرلوحی و همکاران، 1388).

2-5-­ گونه­های شناخته شده پروبیوتیک­ها

سویه­های پروبیوتیکی که معمولا استفاده می­شوند،‌ عمدتا متعلق به جنس­های بیفیدوباکتریوم[18] و لاکتوباسیلوس[19] هستند، ولی سویه­هایی از جنس­های لاکتوکوکوس[20]، انتروکوکوس،[21] پروپیونی‌باکتریوم[22]و مخمر ساکارومایسز نیز وجود دارد که پروبیوتیک محسوب می­شوند (ریورا، ‌2010). بیفیدوباکتریوم‌ها باکتری­های گرم مثبتی هستند و می­توانند در محدوده­یpH بین 5/4 تا 5/8 رشد کنند و مهم­ترین مشخصه­ی آن­ها بی­هوازی بودن آن­هاست (آگوست و همکاران، 2006). لاکتوباسیلوس­ها بزرگترین گروه باکتری­های لاکتیک­ اسید هستند که شامل بیش از 50 سویه­ی مختلف است. آنها گرم مثبت هتروژن، میله­­ای، غیراسپورزا و کاتالاز منفی هستند. میکروائروفیل یا بی­هوازی هستند و در شرایط محیطی و متابولیکی متفاوتی می­توانند رشد کنند. محصول اصلی حاصل از تخمیر قند توسط آن­ها لاکتیک اسید است (واسیلجویک،‌ 2008). لاکتوباسیلوس­ها اگزوپلی­ساکارید، پپتید­های ضدمیکروبی و متابولیت­های متفاوت دیگر هم تولید می­کنند. لاکتوباسیلوس­ها در بیشتر موارد به عنوان آغازگر در صنایع استفاده می­شوند (کونینقام و همکاران، 2000). تعدادی از باکتری­های لاکتیک اسیدی که پروبیوتیک شناخته می­شوند در جدول 2-2 آمده است (ساندرس و همکاران، 1999):

جدول 2-2 باکتری­های لاکتیک اسید پروبیوتیک

Non-Lactics	Othey LAB	Bifidiobacterium spp.	Lactobacillus spp.
Bacilluse cereus toyoi""	Enterococcus faecalis	B. adolescentis	L. acidophilus
Propionibacterium freudenreichii	Sporolactobacillus inulinus	B. bifidum	L. casei
		B. infantis	L. delbrueckii subsp. bulgaricus
		B. lactis	L. gallinarum
		B. longum	L. gasseri
			L. johnsonii
			L. paracasei
			L. plantarum
			L. reuteri
			L. rhamnosus

2-5-1- ­گونه لاکتوباسیلوس پلانتاروم

لاکتوباسیلوس پلانتاروم، باکتری بی­هوازی اختیاری است و در محیط دارای قند گلوکونات رشد کرده و گاز دی­اکسید کربن تولید می­کند. رشد بهینه آن 35-30 درجه سانتیگراد است، در 15 درجه سانتیگراد هم رشد می­کند و در 45 درجه سانتیگراد قادر به رشد نیست. کلنی­های آن صاف،‌ سفید و یا زرد رنگ است. این گونه به صورت طبیعی فلور میکروبی بسیاری از فراورده­های تخمیری گیاهی، ‌گوشتی و لبنی است. از نظر ظاهر، باکتری­های میله­ای و به اشکال منفرد،‌ دوتایی و یا زنجیره­ای وجود دارند. ازمزایای لاکتوباسیلوس پلانتاروم می­توان به کاهش نفخ و درد روده، کاهش احتمال ابتلا به اسـهال در کودکان، کاهش التهاب روده در افراد مستعد، کاهش درد در روده افراد حساس، اثرات مثبت بر روی سیستم ایمنی کودکان مبتلا به HIV و کاهش عفونت­های دستگاه گوارش اشاره کرد (دی-وریسا و همکاران، 2006).

2-5-2- لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7

در پژوهش حاضر از باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 با منشاء انسانی به عنوان سویه­ی پروبیوتیک استفاده شد. این سویه توسط میرلوحی (1388) از مدفوع نوزادی ایرانی جداسازی شد، این محقق خصوصیات پروبیوتیکی این سویه را بررسی کرد و به دلایل زیر آن را یک سویه­ی پروبیوتیک معرفی کرد:

1- مقاومت به نمک­های صفراوی و pHهای پایین و شرایط گوارش دستگاه انسان.

2- این باکتری از نظر تولید اگزوپلی­ساکارید و آبگزیری سطحی شبیه پروبیوتیک­های تجاری عمل می­کند.

3- مقاومت سویه نسبت به آنتی بیوتیک.

4- توانایی تولید لاکتیک اسید و ترکیبات ضد میکربی (اکبری و همکاران، 1389).

[1]Functional food

¹Encapsulation

[3] biocapsule

[4]Lactobacillus plantarum A7

[5]Functional food

[6]Basic nutritients

[7]Probiotic

[8]Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus

[9]Streptococcus thermophilus

[10]Bifidobacterium

[11]Co-Culture

[12]Lilly

[13]Stillwell

[14]Parker

[15]Fuller

[16]World health organization

1International Dairy Federation (IDF)

1Bifidobacterium

2Lactobacillus

3Lactococcus

4Enterococcus

5Propionibacterium