بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب

فهرست اختصارات

AB: Acid Box

Al: Aluminium

AP-1: Activator protein 1

APS: Ammonium Persulfate

ASK: Apoptosis signal-regulating kinase

ATP: Adenosine Triphosphate

BDNF: brain-derived neurotrophic factor

Beas-2B: Human bronchial epithelial cells

BFGF: Basic Fibroblast Growth Factor

CA-1: cornu ammonis 1

CaMKII: Ca²+–calmodulin dependent protein kinase II

CAMs: Calcium-Modulated Protein

CCR7: C-C chemokine receptor type 7

Cd: Cadmium

CD: Circular Dichroism

CHO: Chinese hamster ovary

CNS: central nervous system

DAG: diacylglycerol

DGK: Diacyl glycerol kinase

DLS: Dynamic light scattering

DNA: Deoxyribonucleic acid

ERK: Extracellular Signal-Regulated Kinases

FDA: Food and Drug Administration

FGFBP: Fibroblast growth factor binding protein

FGFR: Fibroblast Growth Factor Receptor

Fgp: Floral Genome Project

FRS2: Factor receptor substrate 2

FTIR: Fourier Transform Infrared Spectroscopic

Gab1: Grb2-associated binder-1

GnHCl: Guanidinium Hydrochloride

GDP: guanidine di-phosphate

GRB2: growth factor receptor-bound protein 2

GST: Glutathione S-Transferase

GTP: guanidine tri-phosphate

HEPES: Hydroxyethyl-Piperazine Ethanesulafonic Acid

HIF-1: Hypoxia-inducible factor 1

HSGAG: Heparan Sulfate Glycosaminoglycan

IARC: Agency for Research on Cancer

IL: Interleukin

IP3: inositol 1, 4, 5-trisphosphate

IPTG: Isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside

IQ: intelligence quotient

Itk: Interleukin-2inducible T cell kinase

JNK: c-Jun NH2-terminal kinase

KD: kinase domain

LADD: Lacrimo-auriculo-dento-digital

LTP: long-term potentiation

MAPK: mitogen-activated protein kinase

MBP: Maltose-Binding Protein

NFAT: Nuclear factor of activated T cell

NF-kB: nuclear factor kappa beta

Ni: Nickle

NTA: Ni (2+)-Nitrilotriacetic Acid- 2+Ni

NMDAR: N-methyl-D-aspartate receptor

NO: nitric oxide

NTP: National Toxicology Program

PA: phosphatidic acid

Pb: Plumbum (Lead)

PI3K: Phosphatidylinositol-3 kinase

PIP3: Phosphatidylinositol (3, 4, 5)-trisphosphate

PLEICS-01: Plasmid Leicester-01

PMT: Photomultiplier tubes

PTP: Protein-Tyrosine Phosphatase

RAF: rapidly accelerated fibrosarcoma

RNA: Ribo nucleic acid

ROS: Reactive oxygen species

SAPK: stress-activated protein kinase

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis PAGE

Sef: similar expression to FGF genes

SH3: Src homology 3

SOD: Superoxide dismutase

TEMED: N, N, N, N - tetramethyethylenediamine

TNF: Tumor necrosis factor

TRE: Transcriptional Response Element

TRPC3: canonical transient receptor potential protein 3

WHO: World Health Organization

فهرست شکل ها و جداول:

شکل 1 : نحوه عملکرد کلی FGF و FGFR

شکل 2 : گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2

شکل 3 : ساختمان کلی RTK و انواع FGFR

شکل 4 : ساختمان اصلی یک اسید آمینه

شکل 5 : ساختمان اول، دوم، سوم و چهارم پروتئین

شکل 6 : دسته بندی گیرنده های تیروزین کینازی

شکل 7 : ساختار فاکتورهای رشد فیبروبلاست

شکل 8 : ساختار کریستالی کمپلکس FGF10-FGFR2b

شکل 9 : ا گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی و نواحی فسفریله شدن آن

شکل 10 : برخی از بیماریها و موتاسیون های نقطه ای پاتولوژیک گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی

شکل 11 : مسیر پیام رسانی گیرنده های فاکتور های رشد فیبروبلاستی

شکل 12 : مسیر پیام رسانی Ras/MAPK

شکل 13 : مسیر پیام رسانیPLCy/Ca+2

شکل 14: مسیر پیام رسانی PI3-K/Akt

شکل 15: مسیر سیگنالینگ ROS

شکل 16: پروتئین کیناز فعال کننده میتوژن

شکل 17 : مسیر فسفاتیدیل اینوزیتول-3 کیناز

شکل 18 : فاکتور رونویسی القاء شده 1

شکل 19: مسیر سیگنالینگ NF-kB

شکل 20 : فاکتور هسته ای فعال کننده سلول T

شکل 21: مسیر پیام رسانی AP-1

شکل 22 : عملکرد رسپتور NMDAR و فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز

شکل 23: اثر کادمیوم بر مسیر سیگنالینگ

شکل 24: انواع مسیرهای سیگنالینگ MAPK

شکل 25: اثر نیکل بر مسیر سیگنالینگ

شکل 26: آبشار سیگنالینگ فسفولیپید

شکل 27: ساختار شیمیایی اسیدآمینه های تیروزین ، تریپتوفان و فنیل آلانین

شکل 28: دیاگرام جابلونسکی

شکل 29: دناتوراسیون پروتئین

شکل 30: ساختار شیمیایی اوره و گوانیدین هیدروکلراید

شکل 31: پروتئین های نوترکیب و مزایا

شکل 32: استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین

شکل 33: توالی ژنی ناحیه کینازی و نقشه شماتیک از پلاسمید pLEICS-01

شکل 34: شمای کلی از روش ترانسفورماسیون

شکل 35: روش انجام SDS-PAGE به منظور بررسی بیان پروتئین

شکل 36: تخلیص پروتئین با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی

شکل 37: اسپکتروفلوریمتری Cary مدل Bio700 (Spectrofluorimetry)

شکل 38: اسپکتروسکوپی CD مدلJasco - J810 Circular dichroism spectroscopy))

شکل 39: اسپکتروسکوپی FTIR مدل (Infrared spectroscopy) Perkin-Elmer Spectrum RXI

شکل 40: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coli در دمای 37 درجه سانتی گراد

شکل 41: بیان ژن ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در باکتری E.coliدر دمای 20 درجه سانتی گراد

شکل 42: مقایسه‏ی حلالیت ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b در دو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد

شکل 43: خالص‏سازی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی حاوی Ni²+-NTA

شکل 44: نتایج SDS-PAGEبعد از دیالیز

شکل 45: بررسی عملکرد ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b خالص شده

شکل 46: بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b با استفاده از دستگاه CD

شکل 47: بررسی تاثیر سرب بر پروتئین مورد نظر در دستگاه FTIR

شکل 48: بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

شکل 49: بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

شکل 50: بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b

جدول 1: جدول متغیرها

جدول2: خصوصیات فلوئورسنس اسیدآمینه های آروماتیک

جدول 3: رنج نرمال و سمی فلزات سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل در مایعات بدن.

 

فهرست مطالب

فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع. 3

1-1- مقدمه4

1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی. 4

1-1-2- گیرندههایفاکتوررشدفیبروبلاست.. 4

1-1-3- گیرندههایفاکتوررشدفیبروبلاست نوع2. 5

1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی.. 6

1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون. 8

1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق. 9

1-3- اهداف طرح9

1-3-1- هدف اصلی. 9

1-3-2- اهداف فرعی. 9

1-3-3- اهداف کاربردی.. 10

1-3-4- فرضیات.. 10

1-3-5- متغییرها10

فصل دوم مروری بر متون گذشته. 11

2-1- پروتئین12

2-1-1- ساختمانپروتئینها13

2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی.. 17

2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 18

2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی. 20

2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی. 22

2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی. 25

2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی. 29

2-2- فلز چیست؟31

2-2-1- فلزات سمی. 31

2-2-3-سرب.. 32

2-2-4-کادمیوم32

2-2-5- نیکل. 33

2-2-6-آلومینیوم33

2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ. 34

2-7-1-ROS. 34

2-7-2- MAPK.. 35

2-7-3- PI3K/Akt36

2-7-4- HIF. 37

2-7-5- NF-kB.. 38

2-7-6- NFAT. 39

2-7-7- AP. 40

2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن41

2-8-1- سرب.. 41

2-8-2- کادمیوم43

2-8-3- نیکل. 46

2-8-4- آلومینیوم48

2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها50

2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها50

2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها51

2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین ها52

2-9-4-تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی. 53

2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD)56

2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون. 57

2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب. 60

2-10-1- کاربرد پروتئین های نوترکیب. 60

2-10-2-پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins )60

2-10-3-تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان. 63

2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین. 64

2-10-5-خالص سازی پروتئین های نوترکیب.. 64

فصل سوم مواد و روش ها. 66

3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش. 67

3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش.. 67

3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش.. 68

3-2- محلول ها و بافرها69

3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین. 69

3-2-2- تهیه ی استوک IPTG.. 70

3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین. 70

3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت تخلیص پروتئین. 70

3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 4%... 70

3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید 12%... 71

3-2-7- تهیه ی محلول APS10%... 71

3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10 (Running buffer)71

3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer))71

3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار. 72

3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار. 72

3-2-12- تهیه ی Staining Buffer72

3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer73

3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید73

3-2-15- تهیه بافر SDS. 73

3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer)73

3-2-17- تهیه بافر B ( (Eluting Buffer74

3-2-18- تهیه بافر دیالیز. 74

3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl)74

3-2-20- تهیه استوک فلزات.. 74

3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری.. 74

3-3- روش انجام کار75

3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b. 75

3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب.. 77

3-3-3- تعیین غلظت پروتئین. 83

3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 83

3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD))85

3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR.. 86

3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس.. 87

فصل چهارم یافته ها و نتایج................................................................................................................................................... ................................................................................................................................................... 88

4-1- بررسی بیان پروتئین در دمای 37 درجه سانتی گراد88

4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای20 درجه سانتی گراد89

4-3- بررسی حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای20 و 37 درجه سانتی گراد90

4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده91

4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز92

4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده93

4-7- بررسی ساختار سوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیبFGFR2b94

4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b98

4-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیبFGFR2b101

4-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه‏ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b104

فصل پنجم بحث و نتیجه گیری.. 109

5-1- بحث و نتیجه گیری. 110

فهرست منابع:116

….………………………………………………………………………………..Abstract125

 

چکیده

زمینه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند.عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFRبا بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است.از این گروهگیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو در مسیر پیام‏رسانی سلولی و تنظیم فرآیندهای مهم زیستی از جمله تمایز و تکثیر سلولی نقش اساسی دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.

هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.

مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسمیدpLEICS-01 ، باکتری BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوی Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئین بعد از دیالیز توسط تعامل با ناحیه SH2 فسفولیپاز(PLC)C طبیعی و موتان توسط روش PAGE بررسی شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئین خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.

یافته‏ها: بررسی SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئین بیان شده در دمای 20 درجه سانتی گراد محلول است. نتایج PAGE فعال بودن پروتئین خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.

بحث و نتیجه‏گیری: باتوجه به یافته ها، ناحیه‏ کینازی گیرنده‏ نوترکیب عامل رشد فیبروبلاستی 2b که یک پروتئین 38 کیلودالتونی است تولید و خالص گردید و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.

کلیدواژه‏ها: گیرنده‏ فاکتور رشد فیبروبلاستی، ناحیه کینازی، سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس، CD، FTIR

فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع

1-1- مقدمه

1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی

فاکتور رشد فیبروبلاستی یا FGF (شکل 1) پروتئینی است که در بسیاری از فرآیندهای سلولی نظیر تقسیم سلولی، تکوین جنین، رگ زایی و بسیاری از فرآیندهای دیگر نقش دارد. به علاوه، این پروتئین به عنوان یک فاکتور مهم به محیط کشت سلولهای بنیادی جنینی انسانی اضافه می شود تا بتوان سلول ها را در حالت بنیادینگی و بدون تمایز حفظ و تکثیر کرد (1).

1-1-2- گیرندههایفاکتوررشدفیبروبلاست

گیرندههایفاکتوررشدفیبروبلاست(FGFR) درمسیرپیامرسانیسلولنقشکلیدیدرتنظیم فرآیندهایزیستیازجملهتکثیرسلولی، بقا،مهاجرتوتمایزسلولیایفامیکنند (2). متابولیسم سلولی، ترمیمبافتی،رگزاییوتوسعهیمراحلجنینیازجملهوظایفیهستند کهدردورانجنینیو بزرگسالیدربدنتوسطاینگیرندههابااتصال بهفاکتورهایرشدفیبروبلاستی (FGF) انجام می شود(3). فرمهای موتاسیونیافتهیگیرندههایفاکتوررشدفیبروبلاستیدرسرطانهایمتعددیاز جملهسرطانریه،پستان،معده،مغز،سروگردن،پروستات، کولون،رحم،مثانهوهمچنینمولتیپل میلوماشناختهشدهاست(6-4). عدم تعادل در انتقال پیام (سیگنالینک) FGFR با چندین اختلال پاتولوژیک انسانی مانند سندرم های اسکلتی مرتبط است (4). در این میان، FGFR2، نقش مهمی را در رشد و ترمیم بافتی بویژه استخوان و عروق خونی دارد.

شکل 1: نحوه عملکرد کلی FGFو .FGFR

1-1-3- گیرندههایفاکتوررشدفیبروبلاست نوع2

پروتئین نوترکیب FGFR2b (شکل2) متعلق به خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (FGFR) است. این پروتئین دارای 334 اسید آمینه و وزن مولکولی تقریبی 38 کیلودالتون می باشد. تغییراتژنتیکیدراینگیرندهباسرطانهایاندومتریال،تخمدانوپستاندرارتباطمیباشد. قابلذکراستکهنوعجهشیافتهاینگیرندهدرتعدادیازسرطانهاگزارششدهاستکهباافزایشپیاممرتبطبااینگیرندهدرارتباطمیباشد(7).

دراینپروتئیننوترکیبباانتقالالگویموتاسیونمشاهدهشدهدرگیرندهبیانشدهدرسلولسرطانی،فرمفعالونوترکیبناحیهیتیروزینکینازیپروتئینFGFR2bایجادشدهاستکهدارایجهشهایموردنظرمیباشد. قابلذکراستکهتهیهیناحیهیتیروزینکینازیپروتئینFGFR2b بهصورتخالصاین امکانرافراهممیکند کهدرمطالعاتبعدیبتواناطلاعاتیراجعبهساختارونیزبررسیبرهمکنشپروتئینولیگاندازجملهاثرمهارکنندههایمختلفرارویناحیهیکینازیاینپروتئینبهدستآورد.

بر این اساس در این تحقیق، تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش با فلزاتی که ذکر می شود، بررسی می گردد.

شکل 2: گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع 2.

1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی

گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی متعلق به خانواده‏ای از گیرنده‏های تیروزین کینازی (شکل 3) هستند. این گیرنده ها دارای دو ایزو فرم b و cمی باشند که هرکدام به ترتیب در بافت های اپی تلیال و مزانشیمال بیان می شوند. هم چنین هفت گیرنده‏ در خانواده ی گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی (شکل3) جای می گیرد که شامل FGFR1b، FGFR1c،FGFR2b ، FGFR2c، FGFR3b، FGFR3c و FGFR4 می‏باشد(8). این گیرنده ها در مسیر پیام‏رسانی سلول نقش کلیدی در تنظیم فرآیندهای زیستی از جمله تکثیر سلولی، بقا، مهاجرت و تمایز سلولی ایفا می‏کنند (9). همه آن‏ها دارای یک بخش داخل غشایی، یک ناحیه خارج سلولی متصل شونده به لیگاند و یک ناحیه داخل سلولی که خاصیت تیروزین کینازی دارد هستند. گیرنده ی FGFR2b ایزوفرم اپی تلیال گیرنده ی فاکتور رشد فیبروبلاستی است. ناحیه ی کینازی FGFR2b متشکل از 334 اسیدآمینه می باشد و دارای ساختار به صورت دو ناحیه ی کینازی N-terminal وC-terminalاست که توسط یک ناحیه ی اتصال دهنده انعطاف پذیر به هم مرتبط می شوند. این ناحیه ی اتصال دهنده حلقه ی فعال سازی نیز نامیده می شود که در عملکرد فسفریلاسیون تیروزین های ناحیه ی کیناز ی گیرنده نقش مهمی دارد. تقریبا %20 ژن‏های انسانی محصولاتی را کد می‏کنند که در مسیرهای پیام‏رسانی (سیگنالینگ) سلولی مشارکت دارند. تنظیم‏کننده‏های اصلی این مسیرها از طریق واکنش‏های فسفریلاسیون/ دفسفریلاسیون عمل می‏نمایند. آنزیم‏های تیروزین کیناز دسته‏ای از آنزیم‏ها هستند که مسئول فسفریلاسیون اسیدآمینه تیروزین روی پروتئین هدف خود هستند. دو خانواده از آنزیم‏های تیروزین کیناز وجود دارد که عبارتند از گیرنده های کینازی متصل به غشاء و کینازهای سیتوپلاسمی که گیرنده نیستند. ناحیه کاتالیتیکی از تیروزین کیناز شامل مکان اتصال به مولکول ATP ویژه و مکان اتصال به سوبسترا است (10).

الف)

ب)

شکل 3: الف) ساختمان کلی RTK. ب) انواع FGFR.

1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون

جهش‏های نقطه‏ای در نواحی خارج سلولی، داخل غشایی و داخل سیتوپلاسمی باعث دایمریزیشن و یا اتوفسفریلیشن بدون ایجاد اتصال بین لیگاند و گیرنده می‏شوند. فعال‏سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون باعث فعالیت کینازی مداوم این آنزیم‏ها می‏شود. مکانیسم‏هایی که این موتاژنز آنزیمی را ایجاد می‏کنند شامل ترانس لوکشن کروموزومی یا موتاسیون های نقطه‏ای است که سبب تغییر در نواحی خارج سلولی، تغییر در ناحیه اتصال به ATP و تغییر در بخش کاتالیتیکی کیناز است. همه‏ی کینازها در فرم فعال از نظر کنفورماسیون شباهت زیادی با هم دارند در حالی که در فرم‏های غیر فعال از نظر ساختاری با یکدیگر متفاوت‏اند. آنکوژنیک تیروزین کینازها تنظیم فرآیندهای سلولی را مختل و یک فنوتیپ پاتولوژیک ایجاد می‏کنند، بنابراین به نظر می‏رسد که این پروتئین‏ها به عنوان یک هدف درمانی جالب توجه برای درمان سرطان باشند (11).

1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق

درمطالعات انجام گرفته چندین جهش افزایش انتقال پیام در ناحیه ی کینازی FGFR2bدر سرطان‏های اندومتریال، تخمدان و پستان شناسایی گردیده است. هم چنین مشخص شده است که اختلال تنظیمی مسیر پیام‏رسانی گیرنده‏های فاکتور رشد فیبروبلاستی که می‏تواند ناشی از تغییرات ژنتیکی باشد با ایجاد سرطان ارتباط تنگاتنگی دارد (12). طبق مطالعات صورت گرفته، برخی فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، می توانند سبب اختلال در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و در نتیجه بروز بیماریهای متعددی شوند. یکی از سازوکارهایی که در ارتباط با اثر این ترکیبات روی رشد سلول‏های سرطانی مطرح می‏باشد اثر این ترکیبات بر روی مسیر انتقال پیام با واسطه تیروزین فسفریلاسیون می‏باشد (15-13). طبق دانش ما تاکنون برهمکنش FGFR2b KD با فلزات سمی از جمله؛ سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم، در مطالعه ای گزارش نشده است. بر این اساس در این مطالعه تغییرات ساختاری پروتئین نوترکیبFGFR2b KDبر اثر برهمکنش با سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم با کمک تکنیک های اسپکتروسکوپی شامل فلوئورسانس، CD و FTIR بررسی می‏گردد.

1-3- اهداف طرح

1-3-1- هدف اصلی

بررسی بیان و تخلیص ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2bو بررسی تغییرات ساختاری آن بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.

1-3-2- اهداف فرعی

بیانپروتئیننوترکیبدر باکتری E.Coli.

تخلیص پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی.

بررسی تغییرات ساختاری پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b بر اثر برهمکنش آن با فلزات سمی.

1-3-3- اهداف کاربردی

مشخص شدن عوامل موثر در تغیییر ساختار پروتئین نوترکیب FGFR2b می تواند در درمان برخی سرطان ها و بیماری ها موثر باشد.

1-3-4- فرضیات

پروتئین نوترکیب در باکتری E.Coli بیان می شود.

پروتئین نوترکیب توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی خالص می شود.

ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با سرب تغییر می‏کند.

ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با کادمیوم تغییر می‏کند.

ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با نیکل تغییر می‏کند.

ساختار ناحیه کینازی پروتئین جهش‏یافته نوترکیب FGFR2b در برهمکنش با آلومینیوم تغییر می‏کند.

1-3-5- متغییرها

عنوان متغیر	مستقل	وابسته	کمی		کیفی		تعریف علمی	مقیاس
			پیوسته	گسسته	اسمی	رتبه ای
بیان پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b		*		*			غلظت پروتئین	mg/ml
فلزات سمی	*			*				ppb
بررسی تغییر ساختار سوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b		*		*			تکنیک فلوئورسانس تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب	Flourescence Intensity
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b		*		*			تکنیک پولاریزه تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب	CD Spectropolarimeter
بررسی تغییر ساختار دوم پروتئین جهش یافته نوترکیب FGFR2b		*		*			تکنیک اسپکترومتر تغییر ساختاری پروتئین نوترکیب	FTIR cm-1

جدول 1: جدول متغیرها. متغیرهای مورد آزمایش، تعریف علمی هریک و مقیاس اندازه گیری آن ها.